新|基于CAR修饰的免疫细胞疗法发展与应用的研究进展

近年来，过继性细胞免疫疗法在肿瘤治疗方面展现出了显著的临床效果。T细胞和自然杀伤（natural killer，NK）细胞是临床常用的过继性免疫细胞，并且在淋巴瘤等恶性肿瘤的治疗中已经取得了良好的效果。通过对免疫细胞进行基因工程改造引入嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）催生了CAR-T和CAR-NK细胞疗法。CAR-T和CAR-NK细胞可高效识别肿瘤抗原且肿瘤细胞杀伤效果较好，在多种癌症研究中均有满意的结果，已经成为一个炙手可热的领域。此文对基于CAR修饰的免疫细胞疗法的发展与应用进行概述，并针对其挑战与未来发展进行了讨论。

1细胞免疫治疗

肿瘤生物治疗是一种新兴肿瘤治疗模式，主要包括肿瘤免疫治疗、溶瘤病毒治疗、干扰小RNA技术疗法等。肿瘤免疫治疗通过重新启动并维持肿瘤-免疫循环，恢复机体正常的抗肿瘤免疫应答，从而控制与清除肿瘤，比传统的肿瘤治疗方法更加安全并且具有特异性，对晚期肿瘤具有显著的疗效。肿瘤免疫治疗包括4大类：过继性细胞免疫疗法、肿瘤疫苗、非特异性免疫刺激以及免疫检查点单克隆抗体。其中过继性细胞免疫疗法是目前研发热点，也是肿瘤治疗研究中开展最广泛、最深入的领域之一，其具体过程是通过对自体或异体免疫细胞进行体外激活或基因修饰，扩增出足够的具有抗肿瘤活性的免疫细胞后回输给患者。过继性免疫细胞主要包括T细胞、自然杀伤（natural killer，NK）细胞、肿瘤浸润淋巴（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）细胞、淋巴因子激活的杀伤（lymphokine-activated killer，LAK）细胞、细胞因子诱导的杀伤（cytokine induced killer，CIK）细胞、巨噬细胞和树突状细胞（dendritic cell，DC）等几大类。

将免疫细胞的杀伤活性与抗体的特异性相结合，通过对免疫细胞进行基因工程改造引入嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）使其靶向表达特定抗原的肿瘤细胞，推动了CAR-T和CAR-NK细胞疗法的发展。CAR是CAR-细胞的核心部分，它使细胞能够不依赖于HLA而通过CAR结构识别更广泛的肿瘤靶抗原。CAR基本结构包括肿瘤相关抗原结合域、通常来自单克隆抗体的抗原结合区域的单链抗体（single chain variable fragment，scFv）、胞外铰链域、跨膜域和胞内信号域。scFv可以与肿瘤细胞表面表达的肿瘤相关抗原紧密结合，这决定了 CAR结构的特异性。铰链域是细胞外区和跨膜域之间的连接序列，它给予CAR充分的定向性和灵活性来与肿瘤抗原结合，会影响CAR-细胞的活性。跨膜域位于铰链和胞内信号域之间，包括CD3 HLA-A2或CD28。胞内信号域的结构决定了CAR-细胞激活信号的强度，其中包含免疫受体酪氨酸激活基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）。目前最经典的胞内结构域是CD3 ITAM的激活区。为了提高CAR修饰的效应细胞的增殖和细胞毒作用，可在胞浆尾部加入共刺激蛋白受体，如CD28、4-1BB、CD134、ICOS等。针对CAR结构的研究除了选取合适的靶向位点scFv，很多研究专注于作为CAR-细胞功能关键区域的胞内信号域，目前已经发展了4代。第1代CAR介导的细胞激活仅通过CD3ζ链完成，抗肿瘤活性有限。第2代CAR在胞内结构域中增加了1个新的共刺激信号，包括1条CD3ζ链和1个共刺激分子对CD3ζ链的信号进行放大，并与其具有相同的抗原特异性，增加了细胞增殖、细胞因子分泌和抗凋亡蛋白的分泌。广泛使用的共刺激分子有 CD28、4-1BB和 CD134（OX40）等。第3代CAR包括1条CD3ζ链和2个或2个以上不同的共刺激分子，使其抗肿瘤效应进一步提高。第4代CAR则通过基因修饰分泌特定的细胞因子或表达额外的共刺激配体增强CAR-细胞的疗效，同时引入了自杀基因系统控制CAR-细胞活性，必要时激活使CAR-细胞凋亡，防止对自体造成损害。CAR结构在免疫细胞中的广泛应用，引导免疫细胞特异性靶向识别肿瘤抗原并介导免疫细胞的激活，从而提高了过继性免疫疗法的适用性和有效性。CAR-细胞对血液肿瘤的治疗具有良好的效果，在实体肿瘤的治疗上也取得了一定的进展，表1中列出了近期CAR-细胞治疗的临床研究。

 本文对CAR-细胞疗法发展与现阶段应用进行概述，并对不同种类的CAR-细胞治疗的特点及优势进行总结，分别介绍了各自的潜力及应用，并针对其挑战与未来发展进行了讨论。

2CAR修饰的T细胞

2.1CAR-T细胞概述

T细胞在细胞介导的免疫应答中起着关键作用，参与监测和杀死肿瘤细胞或潜在的恶性细胞。基于T细胞的过继免疫疗法治疗恶性肿瘤，特别是血液病癌症效果显著。这种新出现的治疗包括3个模型：TIL、T 细胞受体（T cell receptor，TCR）修饰的T细胞（TCR-T）和CAR-T。与CAR-T疗法相比，前两种技术并没有对T细胞本身进行大的修饰，疗效并不显著，较低的成功率以及对疫苗的依赖也限制了它们的发展。作为一种很有前途的过继免疫治疗方案，CAR-T细胞疗法已接受了超过25年的时间考验，能够识别和消除特定的癌细胞，独立于 MHC。

现阶段全球范围已开展的临床试验以第2代CAR-T为主，以CD28或CD137共刺激域构成。一般认为，CD28所传递的活化信号，相较于CD137更强，可使T细胞在较短时间内达到很高的杀伤活性；而CD137所传递的活化信号则会维持得更久。此外，由于CAR-T细胞常常无法进入肿瘤内部，因此主要用于治疗血液系统肿瘤，在实体瘤的治疗中还未见显著的成效。第4代CAR-T细胞在CAR的设计中添加了细胞因子或者趋化因子的受体结构，从而增加T细胞在肿瘤组织中的浸润，以达到增强杀伤实体瘤的效果。

2.2CAR-T细胞在抗肿瘤治疗中的应用

美国FDA共批准了 5款CAR-T细胞产品上市，分别是瑞士诺华公司的Kymriah用于治疗急性B 淋巴细胞白血病（B-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）、美国吉利德公司的Yescarta用于治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）以及Tecartus用于治疗套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）、美国百时美施贵宝公司的Breyanzi用于治疗复发或难治性（ralapsed/refractory，R/R）大 B 细胞淋巴瘤（R/R large B cell lymphoma，R/R LBCL）、美国百时美施贵宝公司和Bluebird Bio公司共同研发的Abecma用于治疗多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）。中国有2款CAR-T细胞产品获批上市，分别为上海复星凯特生物科技有限公司的阿基仑赛注射液用于治疗成人R/R LBCL、上海药明巨诺生物科技有限公司的瑞基仑赛注射液用于DLBCL。上述产品中除Abecma为APRIL靶点外，其余都是CD19靶点。随着大量临床研究的开展，针对不同靶点的CAR-T细胞还有望应用于急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）、慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）、B细胞淋巴瘤（B cell lymphoma，BCL）、MM及实体瘤等。

目前治疗ALL，特别是高病死率的R/R B-ALL最适合的方法就是CAR-T细胞治疗，其中最有效的是抗CD19抗体CAR，CD19是B细胞的重要生物标志物，在B-ALL中有较高的表达。尽管CD19是CAR-T细胞治疗ALL的理想靶点，但研究发现“抗原逃逸”是免疫疗法发展的潜在障碍，当务之急是进行优化，包括识别其他靶点。CD22是CAR-T细胞的另一个潜在靶点，2种不同的抗CD22药物已经在临床试验中用于治疗B-ALL，以弥补抗CD19治疗的不足。

由于CLL发病机制导致早期免疫缺陷，因此CAR-T细胞治疗的疗效受到来自CLL患者的T细胞体外扩增困难及体内增殖反应的限制。Ibrutinib是一种不可逆的布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂，它不仅可以避免对T细胞的负面影响，还可以提高其抗肿瘤能力。有研究表明，5个周期的Ibrutinib治疗增强了靶向CD19的第2代CAR-T细胞（CTL019）的扩增，并降低了程序性细胞死亡蛋白1在T细胞上的表达；同时增加了 B细胞中CD200的表达，而CD200/CD200受体在调节抗肿瘤免疫方面发挥重要作用。

CAR-T细胞是治疗R/R B细胞非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）的最新免疫疗法，除抗CD19 CAR-T细胞外，4次跨膜蛋白CD20出现在90%以上的BCL中，是公认的NHL治疗靶点。目前，第1代抗CD20 CAR-T细胞治疗已经在一些研究中使用。

CD30是TNF受体（TNF receptor，TNFR）超家族的成员，也可以作为淋巴瘤治疗的潜在靶点。在霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma，HL）中，它是Ki-1抗体的抗原，与里德-斯德伯格细胞结合。CD30阳性淋巴细胞主要分布在淋巴组织的滤泡区周围，而在生发中心不常见。对于淋巴瘤，CD30在经典的HL、间变性大细胞淋巴瘤、DLBCL、原发性纵隔BCL和外周T细胞淋巴瘤中表达。有研究报道，靶向CD30的CAR-T细胞在经高强度淋巴清除预处理后的R/R HL患者中表现出显著的抗肿瘤活性和较低的毒性。

MM是一种骨髓来源的难治性恶性肿瘤，由于骨髓瘤的异质细胞遗传学和分子异常原因，这种疾病仍然无法治愈。膜蛋白CD138属于硫酸肝素蛋白聚糖的Syndecan家族，在恶性和分化的浆细胞表达，也存在于肿瘤、成熟的上皮细胞和其他正常组织中。由于CD138在几乎所有MM患者中都有表达，因此被用作主要诊断标志物。临床试验结果显示，使用第2代抗CD138 CAR-T细胞治疗5例难治性MM患者后，4例病情稳定，1例晚期浆细胞白血病患者外周血骨髓瘤细胞减少，这表明CAR-T细胞已经进入骨髓。由此可见，抗CD138 CAR-T细胞治疗MM具有良好的耐受性和潜在的抗肿瘤免疫效果。

2.3CAR-T细胞面临的挑战

CAR-T细胞治疗面临的主要问题是如何提高过继性细胞的有效性和持久性，以及减少治疗的不良反应。

为了增强治疗效果，可以通过添加新的共刺激域或CAR部分来提高CAR-T细胞的有效性和持久性。糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白（glucocorticoid-induced TNFR-related protein，GITR）即CD357和4-1BB都是核因子-κB诱导的TNFR超家族成员，而GITR是组成性表达于T细胞的共刺激分子，添加该结构域或结合CD28和4-1BB可以进一步增强T细胞的作用。对于淋巴瘤、MM和其他类型的恶性肿瘤中存在的抗原逃逸或多种肿瘤抗原共存现象，重建CAR部分是一种新的方法。双特异性CAR-T细胞是很有前途的治疗方法，它包括2种形式：（1）1个CAR由2个不同的scFv组成（TanCAR），或者2个不同的CAR在1个T细胞上连接不同的scFv（双信号CAR）；（2）依次或同时注入不同类型的CAR-T细胞池。此外，使用带有趋化因子基因的溶瘤病毒招募CAR-T细胞，可延长它们的持久性并直接攻击肿瘤细胞。这是一种很有前景的方法，可用于血液系统恶性肿瘤的检测。溶瘤病毒可以感染宿主，复制并破坏某些肿瘤细胞，而不伤害正常细胞。有证据表明，肿瘤细胞可以通过MHCⅠ在其细胞质中整合呈递新病毒蛋白，被CD8+ T细胞识别和摧毁。使用黏液瘤病毒、5型腺病毒和柯萨奇病毒A组21型等病毒杀灭这种类型的肿瘤细胞的应用已在MM中报道。

在CAR-T细胞治疗过程中，避免失控的T细胞增殖、细胞因子风暴或靶向/非靶向肿瘤效应至关重要，可以激活自杀基因（也称为消除基因）系统来破坏注入的CAR-T细胞，调节CAR-T细胞的扩增并限制毒性。目前，单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦自杀基因治疗在同种异体造血干细胞背景下已经显示了其安全性和有效性；其他非免疫原性自杀系统，如经过修饰的内在凋亡途径中的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（caspase 9，Cas9）也已经被开发出来。然而，这种自杀策略是通过彻底消除CAR-T细胞来缩短治疗时间。“可转换的”CAR-T细胞弥补了这个缺陷，通过在scFv和T细胞表面之间插入一个小的分子复合物来启动细胞功能并通过停止添加它来关闭细胞功能。另一种切换细胞开启和关闭的方法是设计可溶性细胞间分子，包含肿瘤抗原特异性抗体，通过改变中间分子的浓度来改变细胞功能。

CAR-T细胞治疗在治疗恶性血液病，特别是ALL、CLL和淋巴瘤取得了很大的进展，而有效性、细胞持久性和不良反应成为广泛应用的瓶颈，需要更加创新的实验室研究来加强该疗法的有效性。

3CAR修饰的NK细胞

3.1CAR-NK细胞概述

NK细胞是机体内天然免疫系统的核心细胞。与T细胞不同，NK细胞对靶细胞的识别不依赖于MHC的表达，而是依赖于其表面杀伤细胞激活受体和杀伤细胞抑制受体（killer inhibitory receptor，KIR）间的动态平衡。当NK细胞表面的KIR识别出自身MHCⅠ的时候，NK细胞会主动失活，保护宿主细胞不受误攻击；在MHCⅠ改变、缺失或表达较低的肿瘤细胞中，KIR介导的抑制作用减弱，NK细胞以“缺失自我标记”为靶点对肿瘤细胞造成杀伤。NK细胞的杀伤作用主要体现在，NK细胞可以直接释放穿孔素和颗粒酶B，执行诱导靶细胞凋亡的作用；同时，NK细胞可以分泌大量细胞因子，如TNF-a、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）、IFN-γ、IL-3等，对靶细胞起到直接作用，或激活其他种类的免疫细胞对靶细胞进行攻击；NK细胞还能表达Fas配体和TNF相关调亡诱导配体，使靶细胞进入程序性凋亡；最后，NK细胞通过其表面CD16与靶细胞表面的抗原决定簇特异性结合从而发挥抗体依赖的细胞毒性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）作用。除了具有强大的杀伤功能外，NK细胞还具有很强的免疫调节功能，分泌多种共刺激分子，募集和激活其他免疫细胞，如DC和巨噬细胞，间接帮助消灭靶细胞，从而调节机体的免疫状态和免疫功能。

目前NK细胞所用CAR结构大多沿用自CAR-T细胞。大多数CAR-NK细胞使用CD3-ITAM作为信号转导区域进行信号转导，并利用CD3-ITAM启动NK细胞杀伤。CD3ζ二聚体可以传递来自CD16的信号，从而有助于ADCC作用。除单一的CD3型ζ链之外，胞内信号区还包括共刺激结构域，如CD28、CD137（4-1BB）或CD244（2B4）等分子，具有很好的信号转导效应，有助于CAR-NK细胞的杀伤作用。不同的共刺激分子对NK细胞的作用也不同，如在ALL异种移植小鼠模型中，CD244对CAR-NK92细胞的刺激作用强于CD137，可以募集并激活酪氨酸激酶启动激活信号，可能更适合作为CAR-NK细胞的胞内信号域。

与CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞具有多种优势。首先，NK细胞易分离，寿命较短，体内转移的CAR-NK细胞不易过度增殖，导致移植物抗宿主病（graft versus-host disease， GVHD）的风险低。其次，NK细胞分泌的细胞因子主要包括IFN-γ和GM-CSF，比活化CAR-T细胞释放的细胞因子如TNF-а、IL-6、IL-2、IL-8 等更加安全，这些由CAR-T细胞产生的促炎细胞因子可能导致细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS）和神经毒性。除了以CAR依赖的方式杀伤肿瘤靶细胞外，CAR-NK细胞还能以CAR非依赖的方式消除癌细胞，发挥自身天然的杀伤肿瘤细胞的活性，如通过激活NK细胞受体NCR、NKG2D、共刺激受体DNAM-1（CD226）和某些激活的KIR（KIR2DS1、KIR2DS4和KIR2DL4 ）等上调被激活。其次，CAR-NK细胞可以通过表面的CD16介导ADCC作用清除肿瘤细胞。CAR-NK细胞拥有CAR依赖和NK细胞受体依赖的双重杀伤机制，可以有效根除一些不表达CAR所靶向抗原的异种肿瘤。最后，NK细胞可从PBMC、NK细胞系和诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）等中直接获取，价格更加便宜。

CAR-NK细胞中的NK细胞可以从多种来源大规模生产，包括NK-92细胞系、外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）、脐带血（umbilical cord blood，UCB）、CD34+ 造血祖细胞（hematopoietic progenitor cells，HPC）和iPSC。目前大多数CAR-NK细胞的临床试验使用的NK92细胞系在体外具有无限的增殖能力，对反复冻存、解冻的敏感性降低，使生产时间更短，成本更低。然而，NK92细胞系为肿瘤细胞系，具有潜在致瘤风险，缺乏CD16和NKp44的表达，且在输注前需要辐照而失去体内扩增潜力。PBMC是NK细胞的重要来源，GVHD风险低，可以从健康捐赠者PBMC中分离出足够数量的NK细胞，其中90%是成熟表型的CD56dimCD16+ NK细胞，细胞毒作用更强但增殖能力下降，且这种来源的CAR-NK细胞无需辐照处理。同样的方法也适用于从UCB分离NK细胞。UCB的优势是可以选择具有特定HLA类型和特定NK细胞受体特征的供者。然而，UCB单位体积有限，NK细胞数量较少、表型不成熟，黏附分子CD16、穿孔素和颗粒酶B的表达减少，NKG2A等抑制受体表达增加，使获取足够数量的临床级NK细胞成为挑战。同时，PBMC和UCB来源的CAR-NK细胞由不同供者提供，使产品很难标准化。从CD34+ HPC中分化NK细胞是获得大量临床级成熟NK细胞的另一种途径。CD34+HPC可以从骨髓、胚胎干细胞或UCB中分离，在培养系统中扩增和分化为成熟的NK细胞。除上述来源外，iPSC由于可以更有效地设计以稳定表达CAR而成为新兴的CAR-NK细胞来源，从单个CAR-iPSC细胞出发就足以分化为大量高度同源的CAR-NK细胞产品用于临床，为CAR-NK细胞提供了一种可再生的来源。然而，与UCB NK细胞类似，iPSC来源的NK细胞通常表型不成熟。

文章来源：国际生物制品学杂志